神经干细胞移植在脊髓损伤修复中的应用进展

       脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)是临床治疗的世界性难题。脊髓损伤后的病理损害分为原发性脊髓损伤和继发性脊髓损伤。脊髓损伤治疗的难点有如何使缺损的神经元再生,如何恢复功能性轴突的传导功能。国内外传统治疗SCI最常用的方法有手术治疗、药物治疗、康复训练等,但这些方法并不能从根本上解决神经元再生的问题。神经干细胞(nerual stemcells,NSCs)移植是20世纪末神经生物学领域最重要的进展之一,因其具备自我更新和多分化潜能的两个基本特性以及迁移功能和良好的组织融合性的优点,而成为细胞移植治疗神经系统疾病良好的移植材料,为脊髓损伤的治疗提供了新的方法。
1　神经干细胞研究现状
　　1.1　神经干细胞移植的生物学特性　神经干细胞是指具有分化为神经元细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞的能力,能自我更新,通过不对称分裂产生除自身以外的其他细胞,并足以提供大量脑组织细胞的干细胞。其生物学特性有5方面。①趋化性:神经干细胞具有位置特异性的分化潜能,其增殖、分化和迁移,与细胞外基质(ECM)有非常密切的关系;②归巢性:神经干细胞在移植过程中,有向着其起源部位,或功能及解剖区域的特殊趋化作用;③迁移性:神经干细胞移植后,其细胞的密度从注射区向周围逐渐减少;④分化性:包括神经系统损伤区域内局部的微环境影响神经干细胞移植后的分化;骨髓和脐血间充质干细胞向神经原样细胞分化;⑤抗原性:神经干细胞是未分化的原始细胞,不表达成熟的细胞抗原,具有低免疫源性,因此在移植后相对较少发生排斥反应。神经干细胞因上述特性而成为神经系统疾病较理想的移植材料。
       1.2　神经干细胞移植治疗脊髓损伤的可行性　神经干细胞的作用有:①神经干细胞分化后产生的神经元可释放多种神经递质并参与电生理传导;少突胶质细胞主要在白质区域生成髓鞘;星形胶质细胞和小胶质则参与血脑屏障的建立并分泌某些神经营养因子。神经干细胞能改善脊髓局部微环境并启动再生相关基因的顺序表达,使损伤轴突开始再生,它们同时产生多种ECM,填充脊髓损伤后遗留的空洞,为再生轴突提供支持物,同时分化出来的神经元可以和损伤脊髓形成广泛的神经纤维联系和突触连接;②补充外伤后缺失的神经元和胶质细胞③使残存脱髓鞘的神经纤维和新生的神经纤维形成新的髓鞘,保持神经纤维功能的完整性。
       1.3　神经干细胞的移植来源　Gage发现神经干细胞来源主要有以下5方面。
①胚胎组织来源神经干细胞:包括胚胎脑组织来源和胚胎干细胞来源;
②成体组织来源神经干细胞:包括从出生到成年期脑组织的广泛区域;
③神经嵴细胞:神经嵴细胞能自我更新,能够分化形成多种细胞类型,发育早期的神经嵴细胞对骨形成蛋白-2信号更加敏感,说明可能有更大的分化潜能;
④原代细胞培养:原代细胞培养即从脑内特定的部位分离出神经干细胞,并在体外合适的条件下培养,可直接用于神经细胞移植。优点可以与其他神经细胞整合,完成生理学上的细胞替换,理论上可以作为把基因移植的最佳载体细胞;
⑤建立“永生化”神经干细胞系,最常用的方法是通过反转录病毒将编码癌基因蛋白克隆到胚胎神经干细胞中,改变细胞的表型,使部分细胞渡过细胞分裂的危象期而获永生化。永生化的细胞可以携带外源性基因,这对于神经系统的基因治疗带来了希望。目前国内基础研究用的神经干细胞大多是动物胚胎脑组织、胚胎干细胞、人胚胎干细胞来源。临床应用的神经干细胞大多是骨髓来源(自体或异体)、脐血干细胞来源(异体)。目前临床上运用神经干细胞治疗脊髓损伤,多采用人脐血来源的干细胞,其具有来源充分、采集方便且免疫系统处于原始状态、较原始的造血干细胞及间质细胞等具有更强的增殖和分化能力、病毒感染机会较少等优点。
       1.4　神经干细胞的移植途径　神经干细胞采用细胞悬液移植。移植方法可以分为:①将小神经球消化成单细胞悬液,采用立体定向的方法移植到病变部位②侧脑室内细胞悬液注射法,阮奕文等将神经干细胞注射到脑梗死大鼠侧脑室内,发现移植细胞可以穿过室管膜上皮,并迁移到梗死灶周围。但无论是静脉或是侧脑室细胞移植法,都依赖于神经干细胞向病变部位的迁移,所以报道虽认为有效,还没有可靠的、定量的研究证实大多数细胞能最终到达病灶而发挥作用。如果用于临床,神经干细胞通过局部手术移植,病人存在手术风险问题,且不能反复移植以保证干细胞的数量而受到制约。
　　1.5　神经干细胞的移植时机　Okano等认为移植选择急性期,大量自由基及兴奋性氨基酸等物质的存在,神经干细胞存活和分化数量少,再通的神经纤维数目少。如果选择恢复期,则可能出现存活的细胞数量较多,但损伤区域胶质瘢痕已经形成导致再通的神经纤维数目少,因此动物实验证明移植的最佳时机应该是损伤后1周~2周。代广辉等研究兔脊髓损伤后2周~4周以及4周后进行移植神经干细胞,在此期间移植治疗脊髓损伤效果均不理想,可使神经干细胞在宿主体内长期存活、增殖、分化,并且可以与宿主进行融合,以利于对损伤脊髓的修复。但考虑人与动物区别,上述“时间窗”仅供参考,最佳移植时机需大量临床试验做进一步的总结。
2　神经干细胞治疗脊髓损伤的研究现状
       2.1　神经干细胞单独移植治疗脊髓损伤　Nakamura等用TP标记移植到猕猴脊髓损伤的人神经干细胞,发现神经干细胞可以存活、迁移、分化。神经微丝的生长、前肢肌力以及自发性运动活动均优于假手术组。这证明了神经干细胞的特性,且能促进肢体运动功能的恢复。李立新等研究神经干细胞治疗脊髓损伤鼠髓鞘结构的修复作用机制时,发现神经干细胞能明显增强PLP mRNA的表达,促进MBP阳性的髓鞘结构再生和修复,使肢体的运动功能得到明显的改善。李成仁等探讨神经干细胞移植在恢复脊髓损伤传导功能的机制时,用CESP和HRP逆行示踪技术观察大鼠脊髓损伤传导功能恢复情况,发现神经干细胞组的CESP有所恢复但潜伏期较长。王岩峰等在探讨神经干细胞移植促进脊髓损伤修复的机制时,应用RT-PCR法观察神经干细胞移植后,大鼠脊髓损伤区胶质细胞DNF和GAP-43基因表达的变化。BDNF通过神经肽的表达来维持细胞内Ca2+的稳定,并通过抗自由基损伤、提高细胞内抗氧化酶的活性来刺激细胞的修复。发现神经干细胞组能明显上调BDNF mRNA,并促进GAP-43mRNA的表达,能改变脊髓损伤区的微环境。刘媛等也应用RT-PCR法及胆碱酯酶染色的方法,证明了神经干细胞能较好地恢复轴突运输功能并对下肢运动终板有一定的保护作用,在实现了神经元和靶器官突触连接中起到一定的作用。卢坷恩等在探讨神经干细胞移植脊髓损伤细胞保护作用机制的研究中,对各组大鼠进行了爬坡实验及MEP的检测,表明神经干细胞移植后组织水肿减轻,Na+,Ca2+显著降低,K+,Mg2+显著升高。这提示神经干细胞对脊髓损伤的保护作用机制可能与其减少神经细胞离子失衡,改善细胞内微循环有关。Mitsui等探讨永生化神经干细胞移植对脊髓损伤大鼠排泄功能的影响,发现神经干细胞组的单位排尿量明显增加、排尿压力明显减小、残余尿量明显减少,神经干细胞能促进低级排尿中枢功能的恢复。Lu等认为神经干细胞在神经系统损伤后有替代缺失组织的潜能,实验发现神经干细胞在体外能持续分泌几种特殊的神经营养因子,促进轴突的生长,经RT-PCR检测移植的干细胞能在活体内表达神经营养因子,经基因修饰的神经干细胞能表达促进宿主轴突生长的NT-3。证明神经干细胞能分泌生长因子促进宿主神经的生长,基因传递加速这种作用。
       2.2　神经干细胞综合移植治疗脊髓损伤　Cai等在探讨lentivirus介导基因工程的人胚神经干细胞的作用时,发现含有转基因人胚神经干细胞的培养液能诱导鼠背根神经节轴突的迅速增长,所有基因工程的人神经干细胞能表达高水平的GFP和NT-3,此项研究表明lentivirus介导基因工程的人胚神经干细胞不但能促进轴突的再生,同时能成功的表达多种基因。Kegami等发现单纯的神经干细胞移植虽然可以促成脊髓损伤的修复,但在某些情况下,移植的神经干细胞容易黏附在某些活体空腔壁上,较难移行和融合到宿主组织,软骨素黏蛋白(CSPG)作为神经胶质疤痕的构成物能在脊髓损伤后强烈表达,是活体内神经干细胞移植的抑制剂,因此运用软骨素酶亲和-生物素复合物(C-ABC)联合神经干细胞移植治疗脊髓损伤,并比较基因介导组与单独移植组的区别,发现C-ABC能稀释CSPG对移植细胞迁移的抑制作用,促进移植细胞与宿主的融合,促进阳性蛋白43纤维数目的增多和生长,这表明CABC介导的移植组通过减少胶质瘢痕抑制作用以促进神经干细胞在体内的迁移和宿主融合性。 Castellanos等认为轴突虽然在合适的酶作用下有能力再生,但如果缺乏合适纤维生长靶位就会限制脊髓环路的修复。因此,为解决这一问题,首先将TRK-C基因和NT-3因子修饰的神经前体细胞移植到完整的大鼠脊髓内,观察他们的存活与分化,发现两种处理因素联用能促进神经干细胞的存活,减少向星形胶质细胞的分化,并能填补脊髓空洞、促进B-微管蛋白纤维在移植细胞周围的增生。郭加松等在NT-3修饰SCs与神经干细胞联合移植治疗脊髓全横断损伤的研究中,发现SCS经NT-3基因修饰后,过量分泌的NT-3不仅能防止脊髓损伤后神经元的萎缩,促进脊髓损伤结构与功能修复的效果更好,促进受损伤的上行和下行轴突再生。当二者联合移植时有相互促进作用。
李巍等在脊髓损伤大鼠的研究中发现采用BDNF修饰神经干细胞移植后,BDNF基因修饰的神经干细胞能在脊髓损伤移植处存活,强烈表达BDNF。李成仁等在肾母细胞瘤过度表达基因(NOV)修饰神经干细胞移植对损伤大鼠脊髓功能的研究中,发现NOV修饰的神经干细胞和分化出来的子代细胞能恒定表达NOV蛋白,而分化出来的不成熟星形胶质细胞可引导神经元的迁移和轴突的生长。周健洪等对于骨形成蛋白4(BMP4)对脊髓损伤后大鼠功能和神经干细胞的影响研究表明:BMP4可减轻神经损伤症状和对脊髓损伤后神经干细胞有促进增殖作用。Teng等研究表明植入了神经干细胞专门的聚合体支架能使大鼠的共济运动及后肢承重功能得到明显的改善。程映华等用壳聚糖及神经干细胞复合物桥接成年SD大鼠完全性脊髓损伤,可使损伤脊髓恢复解剖上的连续性,植入的复合材料与宿主脊髓达到良好的整合,再生的轴突穿过宿主移植物界面。复合材料在移植后脊髓断端发挥桥梁作用,使再生的神经轴突能跨越损伤区。李晓滨等在督脉电针与神经干细胞联合应用促进全横断脊髓损伤研究,这一机制可能为督脉电针促进受损伤的脊髓组织细胞代谢过程,引起细胞膜的腺苷酸环化酶活性增高,使ATP生成CAMP增加,从而激活神经元和神经胶质细胞内蛋白激酶A的级联反应,启动神经生长因子和细胞营养因子等蛋白质的合成和分泌过程,从而促进脊髓内神经干细胞的存活和分化,以及促进受损神经元的存活及其轴突再生。
3　结语
       神经干细胞移植在实验研究中已取得了较显著的进展,但毕竟动物的解剖、病理生理与人存在差异较大,因此神经干细胞移植入人体后,仍存在着较多的问题。
①干细胞的培养和纯化问题,来源涉及伦理问题,尤其是异体胚胎干细胞的采取,如何保证培养的细胞在人体内一定分化为神经干细胞而不是其他类型的组织细胞;
②移植的时机,虽然已有动物实验研究证明在脊髓损伤后1周~2周移植治疗效果较好,但由于动物与人存在差异,临床移植的最佳时机,仍没有确切的答案;
③病例的遴选是否有特定的范围,存在着有效和无效的病例,这种情况产生的原因是什么?
④尚有不为人知的副反应,如躯体不适、免疫排异反应、能否发生突变产生肿瘤;
⑤在移植入人体后,采取何种指标显示其存活、分化。这一切都需要进一步的临床研究,相信这些问题随着研究的深入,都会得到不同程度的解决。